每周一篇，历时两个半月的生信写作系列推文，今天就要收尾了。作为助力生信发文系列的收官之作，当然要放大招。今天就跟大家分享单细胞测序分析加哪些验证实验，能够使文章锦上添花，更进一层！

　　（6）scRNA数据与bulk RNA数据联合分析挖掘关键基因和目标通路；

　　通过生信分析方法得到的这些研究结果再利用实验方法进行验证，能够使文章结果更有说服力，研究结论更有深度。那单细胞转录组研究常见的验证实验有哪些呢？按照实验目的，可将湿实验分为基础验证实验和功能验证实验：

　　基础验证实验：对测序数据生信分析结果（如鉴定到的细胞群，细胞群marker基因，关键基因的表达特征等）进行实验验证。常见的实验方法包括：

　　FISH实验目的是在RNA水平检测marker基因的表达，确定marker基因在细胞/组织中的定位。实验原理是利用核酸分子的碱基互补配对原则，将人工设计的核酸探针与细胞中的待测RNA互补配对，经变性-退火-复性，形成靶核酸与核酸探针的杂交体，从而在荧光检测体系下对RNA进行定位，定性或半定量分析。该实验是单细胞文章中最常见的验证实验。

　　IHC实验目的是在蛋白水平检测marker基因在组织细胞中的表达及定位。其实验原理是根据抗原抗体反应的原理，用带显色剂标记的特异性抗体来确定组织细胞内的抗原，对其进行定位、定性及相对定量的研究。

　　IF实验目的也是在蛋白水平检测marker基因在组织细胞中的表达及定位。实验原理是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体上标记荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。

　　免疫组化和免疫荧光两种实验都能够在蛋白水平检测marker基因在组织细胞中的表达及定位（可二选一，也可都做），两者的区别比较，参考如下：

　　小编有话说：实验做到这里已经可以作为一篇内容完整的生信加实验的单细胞研究文章了，只做基础验证实验的话，相对工作量小，实验周期短，实验费用低。但是，如果有实验条件，有更高的追求，想冲刺CNS期刊的话，功能验证实验了解一下！

　　功能验证实验：针对生信分析筛选到的关键基因或目标细胞群进行功能机制实验，如基因敲减/过表达后的体内外功能机制研究。常见的实验方法包括：

　　细胞分选实验是根据膜表面marker，利用流式细胞仪分选特定细胞，随后利用RT-qPCR检测目标基因表达，主要用来验证新的细胞群或特定细胞群中目标基因的表达。

　　体外/体内细胞功能实验目的是探究通过生信分析筛选到的特定细胞群（新细胞群或功能细胞）中关键基因（或maker基因）的分子功能或分子调控机制。主要方法是通过体外分选特定细胞后，敲减/过表达关键基因，或者是体内构建关键因子敲除/过表达动物模型，再分析细胞功能相关基因表达变化及细胞表型变化（如细胞凋亡、细胞侵袭转移等），亦可对关键基因调控机制进行研究。

　　细胞谱系示踪是指利用各种方式标记细胞，并对包括其后代所有细胞的增殖、分化以及迁移等活动进行追踪观察，是研究单细胞分化命运的重要技术。

　　细胞群功能研究指的是针对单细胞测序获得的特定细胞群（新细胞/功能性细胞）进行功能研究。实验方法是先通过细胞谱系示踪法观察细胞命运变化，随后构建条件性剔除特定细胞的小鼠模型或条件性剔除特定细胞形成因子的小鼠模型，从而分析特定细胞的功能作用。

　　小编有话说：功能验证实验方法就列举到这里，相对与基础验证实验，功能验证实验工作量大，试验周期长，实验费用高。但是有功能验证实验的话SCI加分力度大的大呀！所以具体选哪些实验，做到什么深度，还是要根据科研需求选择合适实验验证策略。

　　研究背景：环境增塑剂对人类和动物的生育能力是一种威胁，DEHP是人类每天接触到的一种增塑剂，作为一种干扰内分泌的化学物质，可能会引发生殖毒性。

　　研究方法：取母鼠暴露于DEHP后的卵巢细胞进行单细胞RNA测序，通过基因差异表达分析和单细胞发育轨迹分析，揭示DEHP对原始卵泡形成的影响。此外，还进行了生化实验，包括免疫荧光、蛋白免疫印迹和细胞凋亡检测，以验证数据集的生信分析结果。

　　生信分析结果（1）：ScRNA-seq鉴定卵巢中主要细胞类型，并对生殖细胞和卵泡颗粒细胞进行再聚类

　　生信分析结果（2）：探究DEHP对生殖细胞和卵泡形成的影响，筛选到卵泡形成中关键的基因和通路。

　　实验验证结果（1）：卵巢切片的免疫组化检测生殖细胞和颗粒细胞是卵泡形成的主要参与者。（验证细胞群鉴定结果和目标细胞群占比）。

　　实验验证结果（2）：卵巢切片GDF9蛋白染色显示GDF9蛋白定位于生殖细胞，蛋白质水平的Western blot显示DEHP处理后GDF9和LHX8表达下降，表明DEHP降低了卵泡形成所必需的基因的蛋白表达水平。（验证生信分析筛选到的目标细胞群中关键基因的表达特征）

　　实验验证结果（3）：TUNEL检测到DEHP处理后生殖细胞和卵巢体细胞都发生了凋亡。（体外细胞表型实验有了）

　　小编有话说：这里的示例文献小编没有选择实验很多，难度很大的文章，而是选择了这篇以生信分析为主，实验验证内容大概只占两成的文章。因为这篇文章的研究思路还有实验方法都更适合大家学习借鉴。

　　小编还有话说：本期的系列推文暂告一段落，后续橘子和小编还是会与大家分享关于生信的那些事。2022年我们继续一起学习，共同进步。